NPS metabolomics: Structure elucidation of third generation synthetic cannabinoid metabolites and fentanyl analogue metabolites

Urine is by far the most common matrix for drug detection, as the sampling is non-invasive and its window for detection of drugs is wider than for blood. However, the parent compound is often either absent or present at low concentrations in the urine.  In the case of synthetic cannabinoids, typically only a small amount of the parent drug is excreted via the urine meaning that using the parent as a biomarker for intake is insufficient. The use of formed metabolites as biomarkers is therefore a better option. An understanding of synthetic cannabinoid metabolism is therefore critical. In the case of fentanyl analogues, metabolites will make the identification in urine more straightforward, but parent compound might still be present at higher concentration that makes the need for metabolite less critical. However, it is still valuable to understand their metabolism as the metabolites might be active µ-opioid receptor agonists. Given the importance of understanding the metabolism of NPS several studies have been carried out. Many of these studies have been carried out by applying in vitro techniques, such as human liver microsomes or human hepatocytes, while some studies have had access to urine samples. For the samples from the in vitro or in vivo studies, a chromatographic technique coupled with a mass spectrometer has commonly been utilized to separate components of the metabolic mixture in the samples, and to elucidate their structure. However, their structures can in many cases not be fully disclosed given that the mass spectra of certain positional isomers will be indistinguishable.   

The aim of this thesis was to identify the chemical structures of key metabolites of selected synthetic cannabinoids and fentanyl analogues. This was achieved by conducting metabolism studies using human hepatocytes and liver microsomes to tentatively identify the formed metabolites, followed by synthesis of reference substances to enable confirmation of the exact chemical structure of the metabolites. Once identified, the key metabolites can be produced in a larger scale and be made available as reference substances for the forensic community for use in routine urine analysis, as well as in toxicological studies.  

Numerous potential metabolites across different synthetic cannabinoids and fentanyl analogues, such as ADB-HEXINACA, ADB-4en-P-5Br-INACA, ADB-P-5Br-INACA, acetylfentanyl, acrylfentanyl, cyclopropylfentanyl, isobutyrylfentanyl,  4F-isobutyrylfentanyl and 3-phenylpropanoylfentanyl,  were synthesized and characterized. Upon comparison with results from in vitro studies using human hepatocytes, with or without human urine samples, the structure of key metabolites could be revealed. Synthetic methods for scale-up synthesis of these key metabolites were also developed. Moreover, the knowledge collected in this work may be extrapolated to new emerging substances to predict their metabolism and the formed metabolites. 

Nya psykoaktiva substanser (NPS), även kända som "badsalt", "nätdroger" och "forskningskemikalier" definieras som droger som potentiellt utgör ett hot mot folkhälsan, men som ännu inte är listade på FN:s narkotikakonventioner. NPS kan delas in i flera undergrupper. Två av dessa undergrupper är syntetiska cannabinoider och syntetiska opioider, där den senare gruppen inkluderar fentanylanaloger. Dessa substanser är ofta utformade för att efterlikna effekterna av redan etablerade substanser, som exempelvis Δ9-THC och morfin/fentanyl. Anledningen till att dessa nya substanser dykt upp på den illegala narkotikamarknaden är att de utgör ett lagligt alternativ till narkotikaklassade substanser. På grund av de negativa effekter som förknippas med syntetiska cannabinoider och potensen hos fentanylanalogerna, kopplas både typerna ihop med många förgiftningar, varav vissa med dödlig utgång.  

Rättsmedicinska toxikologer och myndigheter har svårt att hålla jämna steg med den stora omsättningen och utvecklingen av NPS, då det alltid dyker upp en ny substans för att ersätta en som nyligen narkotikaklassats. För att bekämpa det allvarliga hotet mot människors hälsa som NPS utgör, behöver olika åtgärder vidtas. För att kunna fastställa identiteten på NPS i toxikologiska fall är referenssubstanser nödvändiga, men då de kemiska strukturerna för NPS initialt oftast är okända, leder detta till att referenssubstanser inte finns tillgängliga.   Urin är överlägset den vanligaste matrisen för detektion av narkotika, vilket beror på att provtagningen är icke-invasiv och att tiden under vilken substanser kan detekteras är längre jämfört med blod.   

Då moderföreningen bryts ned genom metabolism i kroppen blir dess koncentration för låg för att kunna detekteras i urin.  För syntetiska cannabinoider utsöndras vanligtvis endast en liten mängd av modersubstansen via urinen, vilket innebär att användningen av denna som enda biomarkör inte är möjlig. Det är därför ett bättre alternativ att använda de bildade metaboliterna som biomarkörer. Kunskap om metaboliseringen av syntetiska cannabinoider och vilka metaboliter som bildas är därför avgörande för att kunna bedöma vilken NPS som är inblandad.  

När det gäller fentanylanaloger förenklar kunskaper om metaboliter identifieringen av brukad substans genom urinanalys. Modersubstansen kan dock förekomma i högre koncentrationer, vilket gör behovet av metaboliter mindre kritiskt jämfört med syntetiska cannabinoider. Det är dock fortfarande värdefullt att förstå deras metabolism eftersom även metaboliterna kan vara aktiva µ-opioidreceptoragonister. För att förstå metabolismen av olika NPS har flera studier genomförts. Många av dessa studier har utförts genom att tillämpa in vitro-tekniker på humana levermikrosomer eller humana hepatocyter, medan vissa studier har tillämpats på urinprover. Oavsett om in vitro- eller in vivo-studier har utförts, har någon form av kromatografisk teknik i kombination med en masspektrometer nyttjats för att separera metabolitblandningens komponenter och fastställa deras molekylära struktur. I många fall kan strukturen dock inte fastställas fullständigt, eftersom masspektra för vissa positionsisomerer är omöjliga att särskilja.  

Syftet med denna avhandling var att identifiera de kemiska strukturerna hos nyckelmetaboliter för utvalda syntetiska cannabinoider och fentanylanaloger. Detta uppnåddes genom att utföra metabolismstudier med humana hepatocyter och levermikrosomer för att preliminärt identifiera de bildade metaboliterna, följt av syntes av referensämnen för att möjliggöra bekräftelse av metaboliternas exakta kemiska struktur. När de väl har identifierats kan nyckelmetaboliterna produceras i större skala och göras tillgängliga som referensämnen för det rättsmedicinska samfundet för användning i rutinmässig urinanalys, såväl som i toxikologiska studier.  

Flertalet potentiella metaboliter för syntetiska cannabinoider och fentanylanaloger såsom ADB-HEINAXA, ADB-4en-P-5Br-INACA, ADB-P-5Br-INACA, acetylfentanyl, acrylfentanyl, cyclopropylfentanyl, isobutyrylfentanyl, 4F-isobutyrylfentanyl och 3-fenylpropanoylfentanyl, har syntetiserats och karakteriserats. Vid jämförelse med resultat från in vitro- samt in vivo-studier, kunde strukturen för nyckelmetaboliter fastställas. Uppskalningsmetoder för syntes av dessa nyckelmetaboliter utvecklades också. Dessutom kommer kunskapen som samlats in under denna avhandling sannolikt att hjälpa till att förutsäga metabolismen för framtida NPS av denna typ.